real time polymerase chain reaction

دستگاه real-time PCR (ریل تایم پی سی آر) به جهت بررسی میزان بیان ژن های موجودات زنده توسعه یافته است. محدودیتی که سیستم PCR ساده بوجود آورده است عدم توانایی بررسی کمی میزان بیان یک ژن می باشد. لذا سیستمی تحت عنوان real-time PCR ساخته شده و توسعه یافته است. آن چه که مشخص است هدف غایی ژن های موجودات زنده می باشد که کل مجموعه ژنومی تلاش در ساخت محصولاتی از جنس RNA و پروتئین دارد. آن چه که می تواند مشخص کند یک سلول چه ویژگی هایی را در سطح فنوتیپی دارد و در چه سطحی آن ویژگی را بروز می دهد RNA یا ریبونوکلویک اسید های آن سلول می باشد. همچنین جهت مقایسه دو سلول از نظر ویژگی های فنوتیپی نمی توان آن ها را در سطح DNA بررسی نمود، چرا که DNA همیشه ثابت بوده و یک ژن مشخص در بین موجودات یک گونه شباهت بسیاری به هم دارد و هیچ نشانه ای از میزان بیان آن ژن عرضه نمی کند. لذا بررسی بیان یک ژن می تواند در سطح RNA و یا پروتئین انجام پذیرد. از طرفی بسیاری از ژن ها در نهایت به RNA تبدیل شده و نقششان را تحت عنوان RNA به انجام می رسانند. در نتیجه در برخی موارد محصول ژنی به شکل RNA عرضه شده و هیچ گاه قرار نیست به پروتئین ترجمه شود. در اینصورت برای بیان آن ژن مشخص که فقط رونویسی می شود ولی ترجمه نمی شود، فقط RNA مورد بررسی می باشد. مولکول RNA یا ریبونوکلویک اسید به دلیل داشتن اکسیژن در کربن شماره 2 و همچنین تک رشته و کوتاه بودن آن، نسبت به مولکول های DNA واکنش پذیر تر بوده و تخریب پذیری بالایی دارد. در سیستم real-time PCR جهت بررسی بیان یک ژن، ابتدا با کمک آنزیم رونوشت بردار معکوس (Reverse Transcriptase) مولکول های RNA را به DNA های مکمل که عموما cDNA نامیده می شوند، تبدیل می شوند. پس از پایداری مولکول مورد سنجش، وارد سیکل های real-time PCR شده و بیان مورد بررسی قرار می گیرد. دستگاه real-time PCR از یک سیستم اپتیکی بهره برده که توسط آن میزان DNA هر نمونه محاسبه می گردد. زمانی که cDNA سنتز شد، پس از آماده سازی نمونه جهت ورود به سیکل های پلیمریزه شدن، به نمونه DNA رنگی تحت عنوان سایبر گرین اضافه می گردد. سایبر گرین موجب رنگ شدن DNA شده و همچنین خود دارای خاصیت فلورسانتی می باشد. زمانی که real-time PCR سیکل های پلیمریزاسیون خود را شروع کرد، به ازای ساخته شدن رشته های DNA جدید، رنگ سایبر گرین به رشته متصل می شود و دستگاه real-time PCR توسط سیستم اپتیکی خود خوانش فلورسانتی را شروع می کند. لذا دستگاه real-time PCR با خاصیت فلورسانتی سایبر گرین برای هر نمونه یک گراف تکثیر ترسیم می کند. هر نقطه از گراف تکثیر نشان دهنده میزان اتصال سایبر گرین به رشته DNA می باشد و در نهایت گراف که در نمایشگر متصل شده به real-time PCR به نمایش در آمده، به آستانه خود می رسد. این میزان نشان دهنده میزان DNA بیان شده در هر نمونه می باشد.
لذا با توجه به اینکه مقایساتی که کمی گزارش می شوند نسبت به گزارشات کیفی از ارزش بالاتری برخوردار هستند، تکنیک real-time PCR نیز نسبت به تکنیک هایی چون RT-PCR که میزان RNA تولید شده در سلول را به شکل کیفی گزارش می کند، از ارزش بالاتری برخوردار می باشد.

دستگاه real time PCR کمپانی Roche آلمان مدل lightCycler 96
قیمت به ازای هر run ذکر شده